D. A. Power & J. P. Burton & C. N. Chilcott & P. J. Dawes & J. R. Tagg
Аннотация:
В исследования были включены 19 детей с отитом среднего уха, в схему лечения которых после трехдневного курса амоксициллина, назначенного в качестве предподготовки больных детей к установке тимпаностомической трубки, был включен Streptococcus salivarius K12 (препаративная форма – порошок). У двух детей штамм K12 оказывал эффект подавления природных популяций ингибитора S. salivarius. У других детей колонизация штамма K12 распространялась за пределы полости рта, захватывая носоглотку или лимфоидную ткань. У относительно небольшого количества пациентов (33%) колонизация была характерным признаком неудачного применения амоксициллина для предподготовки больных, что значительно уменьшило количество местных популяций S. salivarius перед применением штамма K12 в форме порошка.
Received: 14 April 2008 /Accepted: 29 May 2008
©Springer-Verlag 2008
D. A. Power : J. R. Tagg
Department of Microbiology and Immunology,
University of Otago, P.O. Box 56, Dunedin, New Zealand
e-mail: john.tagg@stonebow.otago.ac.nz
J. P. Burton : C. N. Chilcott : J. R. Tagg
BLIS Technologies Ltd., Dunedin, New Zealand
P. J. Dawes
Otolaryngology and Head and Neck Surgery,
Department of Medical and Surgical Sciences,
University of Otago, Dunedin, New Zealand
Отит среднего уха – одно из распространенных бактериальных заболеваний детей во всем мире. Частые рецидивы болезни могут привести к хирургическому вмешательству или к такому серьезному осложнению, как потеря слуха[1]. В последнее время, все чаще, в качестве альтернативы антибиотикотерапии используются пробиотики, уменьшающие случаи рецидивов заболевания[2,3].
Главными претендентами, которые могли быть использованы в качестве пробиотиков являются альфа-гемолитические стрептококки: Streptococcus mitis, Streptococcus sanguinis и Streptococcus oralis [2], благодаря их способности препятствовать росту главных патогенов, вызывающих инфекции респираторного тракта in vitro. К сожалению, каждый из этих видов относительно часто влияет на развитие инфекционного эндокардита [4].
Совсем недавно негемолитический Streptococcus salivarius K12 (бактерия, которая имеет низкий патогенный потенциал) [5], стала широко использоваться в качестве пробиотика ротовой полости для поддержания в здоровом состоянии слизистой оболочки полости рта и контроля неприятного запаха изо рта.
Сильная ингибиторная активность штамма K12 обусловлена его способностью производить несколько бактериоцинов, включая лантибиотик саливарицин A2 и саливарицин B, закодированные в мегаплазмиде (180-kb) [6, 7].
Доступная форма штамма K12 в виде таблеток, которые состоят из сублимированных и спрессованных клеток, не подходит для младенцев. Применение таблетированной формы может вызвать удушение. В данном исследовании для детей была выбрана порошкообразная форма, вследствие ее эффективной доступности для верхних дыхательных путей.
Порошкообразная форма, которая содержит мальтодекстрин, ксилит и лиофилизированные клетки штамма K12, была предоставлена BLIS Technologies Ltd (Dunedin, New Zealand). Продукт был протестирован на стабильность при 4°С и 25 °С в течение 6 месяцев и показал стабильную жизнеспособность клеток штамма при 4°С, а при 25°С – уменьшение колонийобразующих единиц на грамм с 1,7 × 10 в 10 степени до 5,0 × 10 в 9 степени. Перед началом исследования этическое одобрение было получено от Комитета по Этике города Отаго (Новая Зеландия).
В исследование были включены девятнадцать детей, которые находились в госпитале города Дунедина (возрастной диапазон от 6 месяцев до 5 лет), которых готовили для введения тимпаностомической трубки. За две недели до операции данным пациентам был назначен амоксициллин (125 мг, два раза в день в течение 3 дней), для временного снижения уровня природных популяций стрептококков в ротовой полости, чтобы облегчить последующую колонизацию штаммов K12 в пробиотической форме.
После предварительной терапии антибиотиками, язык ребенка обрабатывали 1 г порошкообразной формы штамма K12 (эквивалентной одной чайной ложке порошка) два раза в день, в течение 10 дней до операции. Для исследования был взят соскоб микробиоты с языка перед антибиотикотерапией, а также во время операции получали материал микробиоты с языка и носоглотки. В некоторых случаях (с согласия родителей) были взяты образцы микробиоты лимфоидной ткани.
Специфическое определение наличия стрептококка в образцах проводилось на питательной среде Mitis Salivarius Agar (Becton, Dickinson and Company, Baltimore,MD). Уровень колонизации пробиотических штаммов первоначально оценивался с помощью метода одновременного антагонистического теста, определяя свойства типичных (больших мягких и бледно голубых) колоний S.salivarius, присутствующих в mitis-sаlivarius культуре.
Исследовалась агаровая культура с широкими зонами ингибирования в «газонной культуре» индикаторного штамма I1 (Micrococcus luteus) и штамма I3 (Streptococcus anginosus)[8]. Использовался метод ERIC-ПЦР-генотипирования (9) по консенсусу энтеробактериального повтора (ERIC), представленного устойчивым ингибированием колоний с целью отличия колоний, имеющих характеристики ERIC-профиля штамма K12 от других устойчиво ингибирующих S. salivarius, которые могли присутствовать в биоматериале до применения штамма K12. Для дальнейшей характеристики выделенных объектов исследования был использован ПЦР-метод для структурирования генов штаммов К12 лантибиотиков SaLA2 и SalB (7).
S. salivarius подавлял рост индикаторов I1 и I3 . ПЦР-положительный для SalA2 и для SalB) был обнаружен в пробах, взятых с языка детей, зарегистрированных под номерами 2, 8, 9 и 15 (Таблица 1). Однако только в пробе, полученной от пациента под номером 8, обнаружено сходство ERIC-ПЦР со штаммом K12.
В последующих исследованиях штамма K12 у 10 из 19 детей было обнаружено необратимое стойкое ингибирование колониями S.salivarius. ПЦР тестирование показало, что K12-подобные ЕRIC профили у всех представителей сильно ингибировали пост-колонии, изолированные у шести детей, первоначально имеющих скрытые неподдающиеся ингибированию группы негативных популяций S. Salivarius.
Реакции на добавление штамма K12 были различны у каждого из четырех детей, которые имели ранее популяции, сильно ингибирующие S. salivarius. У ребенка под номером 2 не было отмечено повышение ингибирующей способности при низком содержании S.salivarius.
У ребенка под номером 8, уже имелась популяция бактерий подобных K12 (по данным ERIC) и их соотношение с K12-подобным S. salivarius существенно увеличилось, после воздействия штаммом K12.
У ребенка под номером 9 так же преобладали устойчивые ингибирующие колонии S. salivarius, но они отличались от K12-ERIC. В общей численности колоний не выявлено изменений при воздействии штаммом K12.
Анализ пробы взятой у ребенка под номером 15, показал значительное увеличение в пропорции популяций, отличных от штамма K12- ингибирующих колоний S. salivarius.
Очевидно, увеличение популяций, ранее образованных BLIS-производящими предшественниками, напоминает более ранние результаты исследования детей на SalA-производящие колонии S. Salivarius, которые, как уже было показано, заметно увеличивают их соотношение. Только одна из проб из носоглотки была положительна культуре штамма K12. Из 7 проб аденоидов только 3 были положительны.
Исследования показали, что применение порошкообразного K12-подобного S.salivarius приводит к образованию колоний у 6 из 18 детей (33%). Эти показания существенно ниже, чем при применении BLIS K12 ThroatGuard™, производительность которых составляет 80%. Более низкие показатели, могут быть обоснованы меньшим временным контактом порошкообразной формы с полостью рта, в отличие от таблетированной формы.
Так как штамм K12 чувствителен к амоксициллину, показатели колонизации, достигнутой при применении штамма в день применения амоксициллина, могут быть относительно низкими. Другая возможная причина низких показателей колонизации – неудачный режим предварительной антибиотикотерапии, направленной на уменьшение содержания врожденного S. salivarius.
Восстановление многих преколонизаций S. salivarius в полости рта у детей, включенных в эти исследования, показывает определенную степень устойчивости к амоксициллину (результат не показан). Таким образом, относительно высокое содержание амоксициклин-устойчивых колоний S.salivarius может быть результатом традиционного лечения этих детей. Участвующие в эксперименте дети многократно болели отитом среднего уха. Как показывает практика, данные инфекции обычно лечатся амоксициллином.
Таб. Колонизация Streptococcus salivarius K12
|
Участник |
Предварительния |
Постколонизация |
||||||||||
|
Полость рта |
Полость рта |
Носоглотка |
Аденоид |
|||||||||
|
A |
B |
C |
A |
B |
C |
A |
B |
C |
A |
B |
C |
|
|
1 |
+ |
0 |
ND1 |
+ |
18 |
+ |
+ |
0 |
ND |
+ |
74 |
+ |
|
2 |
+ |
6 |
— |
+ |
7 |
— |
— |
ND |
+ |
0 |
ND |
|
|
3 |
+ |
0 |
ND |
+ |
95 |
+ |
+ |
98 |
+ |
+ |
14 |
+ |
|
4 |
+ |
0 |
ND |
+ |
0 |
ND |
— |
ND |
— |
ND |
||
|
5 |
+ |
0 |
ND |
+ |
0 |
ND |
— |
ND |
— |
ND |
||
|
6 |
+ |
0 |
ND |
+ |
0 |
ND |
+ |
0 |
ND |
— |
ND |
|
|
7 |
+ |
0 |
ND |
+ |
52 |
+ |
— |
ND |
+ |
48 |
+ |
|
|
8 |
+ |
10 |
+ |
+ |
54 |
+ |
— |
ND |
||||
|
9 |
+ |
94 |
— |
+ |
84 |
— |
— |
ND |
||||
|
10 |
+ |
0 |
ND |
+ |
0 |
ND |
— |
ND |
||||
|
11 |
+ |
0 |
ND |
NS2 |
— |
ND |
||||||
|
12 |
+ |
0 |
ND |
+ |
0 |
ND |
— |
ND |
||||
|
13 |
+ |
0 |
ND |
+ |
80 |
+ |
— |
ND |
||||
|
14 |
+ |
0 |
ND |
+ |
2 |
+ |
— |
ND |
||||
|
15 |
+ |
48 |
— |
+ |
100 |
— |
— |
ND |
||||
|
16 |
+ |
0 |
ND |
+ |
0 |
ND |
— |
ND |
||||
|
17 |
+ |
0 |
ND |
+ |
16 |
+ |
— |
ND |
||||
|
18 |
+ |
0 |
ND |
+ |
0 |
ND |
— |
ND |
||||
|
19 |
+ |
0 |
ND |
+ |
0 |
ND |
— |
ND |
||||
1 — Неопределенный: в каждом случае ND, образцы были отрицательны
2 — Нет пробы
A = Streptococcus salivarius обнаружен
B = процент Streptococcus salivarius, которые имеют штамм К12 – подобны фенотипу, демонстрируется ингибированием индикаторов I1и I3
C = Результат тестирования бактериоцин-производящих, изолированных для генотипов отпечатков типичных штаммов К12 .
Список литературы:
1. Roberts JE, Rosenfeld RM, Zeisel SA (2004) Otitis media and speech and language: a meta-analysis of prospective studies. Pediatrics 113:e238–e248. DOI 10.1542/peds.113.3.e238
2. Roos K, Håkansson EG, Holm S (2001) Effect of recolonisation with “interfering” alpha streptococci on recurrences of acute and secretory otitis media in children: randomised placebo controlled trial. BMJ 322:210–212. DOI 10.1136/bmj.322.7280.210
3. Roos K, Holm SE, Grahn-Håkansson E, Lagergren L (1996) Recolonization with selected alpha-streptococci for prophylaxis of recurrent streptococcal pharyngotonsillitis—a randomized placebo-controlledmulticentre study. Scand J Infect Dis 28:459–462. DOI 10.3109/00365549609037940
4. Douglas CW, Heath J, Hampton KK, Preston FE (1993) Identity ofviridans streptococci isolated from cases of infective endocarditis. J Med Microbiol 39:179–182
5. Burton JP, Wescombe PA, Moore CJ, Chilcott CN, Tagg JR (2006) Safety assessment of the oral cavity probiotic Streptococcussalivarius K12. Appl Environ Microbiol 72:3050–3053. DOI
10.1128/AEM.72.4.3050-3053.2006
6. Wescombe PA, Burton JP, Cadieux PA, Klesse NA, Hyink O, Heng NC, Chilcott CN, Reid G, Tagg JR (2006) Megaplasmids encode differing combinations of lantibiotics in Streptococcus salivarius. Antonie Van Leeuwenhoek 90:269–280. DOI 10.1007/s10482-006-9081-y
7. Hyink O, Wescombe PA, Upton M, Ragland N, Burton JP, Tagg JR (2007) Salivaricin A2 and the novel lantibioticsalivaricin B are encoded at adjacent loci on a 190-kilobase transmissible megaplasmid in the oral probiotic strain Streptococcus salivarius K12. Appl Environ Microbiol 73:1107–1113. DOI 10.1128/AEM.02265-06
8. Tagg JR, Pybus V, Phillips LV, Fiddes TM (1983) Application of inhibitor typing in a study of the transmission and retention in the human mouth of the bacterium Streptococcus salivarius. Arch Oral Biol 28:911–915. DOI 10.1016/0003-9969(83)90086-9
9. de Bruijn FJ (1992) Use of repetitive (repetitive extragenic palindromic and enterobacterial repetitive intergeneric consensus) sequences and the polymerase chain reaction to fingerprint the genomes of Rhizobium meliloti isolates and other soil bacteria. Appl Environ Microbiol 58:2180–2187
10. Dierksen KP, Moore CJ, Inglis M, Wescombe PA, Tagg JR (2007) The effect of ingestion of milk supplemented with salivaricin A-producing Streptococcus salivarius on the bacteriocin-like inhibitory activity of streptococcal populations on the tongue. FEMS MicrobiolEcol 59:584–591. DOI 10.1111/j.1574 6941.2006.00228.x
